Mẫu số …/QTGĐ

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH ADN NHÂN

I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI ÁP DỤNG

1. Đối tượng

          Giám định ADN nhân từ các mẫu sinh học: máu, lông, tóc, niêm mạc miệng, mô, móng, dịch sinh học, dấu vết…

2. Phạm vi áp dụng

Quy trình giám định quy định điều kiện, thủ tục, trình tự và các phương pháp giám định ADN nhân xác định các mối quan hệ huyết thống hoặc truy nguyên cá thể từ các mẫu sinh học.

Áp dụng cho các tổ chức giám định pháp y công lập thực hiện giám định ADN theo trưng cầu /yêu cầu của các tổ chức, cá nhân trong phạm vi cả nước.

1. ĐIỀU KIỆN VỀ NHÂN LỰC, CƠ SỞ VẬT CHẤT, TRANG THIẾT BỊ GIÁM ĐỊNH
2. Nhân lực

– Giám định viên (GĐV): Là người được đào tạo ngành/chuyên ngành sinh học hoặc công nghệ sinh học hoặc Y sinh học di truyền…, đã được bổ nhiệm giám định viên.

– Người giúp việc (NGV) cho giám định viên: là cán bộ chuyên môn của đơn vị được thủ trưởng đơn vị phân công.

– Số lượng GĐV và NGV như sau:

+ Giám định lần đầu: 02 GĐV; 02 NGV.

+ Giám định lại: 03 GĐV; 03 NGV.

+ Giám định lại lần thứ hai: 03 GĐV theo danh sách trong Quyết định thành lập Hội đồng giám định lại lần thứ hai của Bộ trưởng Bộ Y tế và 03 NGV.

+ Trường hợp hội chẩn: Các GĐV và các chuyên gia. Tùy từng trường hợp giám định có thể mời chuyên gia nhưng không quá 07 người.

2. Cơ sở vật chất

Phòng xét nghiệm: Phòng phát hiện dấu vết, phòng tách chiết, phòng PCR, phòng điện di,… Các phòng xét nghiệm đảm bảo sạch sẽ, độc lập, tách biệt để kiểm soát nhiễm trong quá trình thao tác, thực hiện các khâu giám định ADN.

3. Trang thiết bị, hóa chất, vật tư

– Trang thiết bị: Hệ thống phát hiện dấu vết, máy PCR, máy RT-PCR, hệ thống giải trình tự gen, hệ thống điện di mao quản và các thiết bị phụ trợ khác.

– Hóa chất: Các bộ kit dùng cho tách chiết ADN, PCR, điện di, các loại hóa chất khác cần thiết cho từng công đoạn phân tích, vv…

– Vật tư tiêu hao: Các loại ống ly tâm, đầu côn, găng tay, khẩu trang, quần áo bảo hộ, kính bảo hộ, cồn, vv…

III. TIẾP NHẬN HỒ SƠ, PHÂN CÔNG GIÁM ĐỊNH

1. Tiếp nhận hồ sơ

– Cán bộ được giao nhiệm vụ tiếp nhận và lập biên bản giao nhận quyết định trưng cầu/ yêu cầu, hồ sơ giảm định. Hồ sơ giám định do cơ quan trưng cầu/người yêu cầu giám định cung cấp trực tiếp hoặc gián tiếp qua bưu điện. Hồ sơ gửi giám định, gồm:

– Quyết định trưng cầu, yêu cầu giám định hợp pháp.

– Các tài liệu khác có liên quan.

• Nếu hồ sơ đủ điều kiện giám định hoặc hồ sơ cần bổ sung, cán bộ được phân công vào sổ theo dõi và báo cáo lãnh đạo đơn vị để thực hiện tiếp các bước tiếp theo của quy trình này.
• Nếu hồ sơ không đủ điều kiện giám định, cán bộ được phân công báo cáo lãnh đạo đơn vị ra văn bản từ chối giám định trong trường hợp:

+ Hồ sơ không đủ tính pháp lý.

+ Yêu cầu về hồ sơ của cơ quan giám định không được đáp ứng.

+ Nội dung trưng cầu/yêu cầu giám định vượt quá khả năng về chuyên môn, cán bộ, phương tiện, thời gian.

+ Người được giám định (nếu có) khác với người trong hồ sơ giám định.

+ Người được giám định (nếu có) không hợp tác.

+ Không có người giám hộ trong trường hợp quy định bắt buộc.

+ Không đảm bảo về an ninh trong khi thi hành nhiệm vụ.

• Nếu từ chối giám định:

+ Từ chối giám định bằng văn bản, nêu rõ lý do.

+ Trả hồ sơ cho cơ quan trưng cầu/người yêu cầu giám định theo quy định.

2. Phân công giám định

– Căn cứ loại mẫu, chỉ tiêu, lĩnh vực giám định, năng lực của giám định viên, người phụ trách phân công mẫu cho nhóm giám định gồm các giám định viên và người giúp việc để tiến hành giám định.

– Mẫu giao cho các nhóm giám định phải ghi đầy đủ các thông tin của mẫu, ngày giao mẫu, tên của nhóm nhận mẫu vào sổ.

– Sau khi nhận mẫu, nhóm giám định có trách nhiệm tiến hành giám định và ghi lại quá trình giám định theo quy định.

– Nhiệm vụ của GĐV:

+ Các GĐV được phân công nghiên cứu hồ sơ, tài liệu trước khi khám giám định.

+ Liên hệ và trao đổi với đại diện cơ quan trưng cầu và các cơ quan có liên quan.

+ Chỉ đạo NGV chuẩn bị dụng cụ, trang thiết bị để giám định.

+ Trực tiếp phân tích mẫu giám định: chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN, định lượng ADN, PCR, điện di, tính toán xác suất…

+ Các GĐV giám sát, phối hợp với nhau trong quá trình giám định, đối chiếu kết quả, cùng nhau thảo luận, thống nhất trước khi kết luận giám định.

+ Hoàn thiện văn bản ghi nhận quá trình giám định và kết luận giám định.

+ Giải quyết những phát sinh trong quá trình giám định, báo cáo kết quả với lãnh đạo cơ quan.

– Nhiệm vụ của NGV:

+ Chuẩn bị dụng cụ, trang thiết bị, phương tiện bảo hộ.

+ Phụ giúp GĐV trong quá trình phân tích mẫu giám định: chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN, định lượng ADN, PCR, điện di,…

+ Chụp ảnh mẫu giám định.

+ Vệ sinh dụng cụ, thiết bị, phương tiện.

+ Bảo quản mẫu xét nghiệm, mẫu tồn dư, bàn giao mẫu giám định.

+ Phụ giúp GĐV dự thảo văn bản ghi nhận quá trình giám định và kết luận giám định, hoàn thiện bản ảnh giám định trình GĐV duyệt.

+ Hoàn thiện hồ sơ giám định.

+ Các nhiệm vụ khác theo phân công của GĐV.

1. GIÁM ĐỊNH
2. Thu, nhận mẫu

Tùy từng loại mẫu áp dụng các phương pháp thu mẫu theo các mục sau:

1.1. Thu mẫu máu

Bước 1: Xác nhận nhân thân người được lấy mẫu qua giấy tờ tùy thân (Giấy chứng minh nhân dân, Căn cước công dân, Hộ chiếu…), ghi đầy đủ thông tin lên phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh người được lấy mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu…

Bước 4. Dùng bông y tế đã tẩm cồn lau sạch vị trí lấy mẫu.

Bước 5. Lấy máu bằng dụng cụ lấy mẫu chuyên dụng (Kim tiêm, kim chích máu…).

Bước 6. Thấm lấy từ 2-3 giọt máu lên thẻ lấy mẫu/ gạc/ tăm bông vô trùng.

Bước 7. Sát trùng lại bằng bông cồn tại vị trí lấy mẫu.

Bước 8. Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó cho vào phong bì đựng mẫu (không đựng mẫu trong túi nilon hoặc hộp kín).

Bước 9: Lập Biên bản thu mẫu .

Bước 10. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

1.2. Thu mẫu lông/tóc

Bước 1: Xác nhận nhân thân người được lấy mẫu qua giấy tờ tùy thân (Giấy chứng minh nhân dân, Căn cước công dân, Hộ chiếu…), ghi đầy đủ thông tin lên phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh người được lấy mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu…

Bước 4. Dùng tay hoặc kẹp nhổ từ 5 đến 10 sợi tóc/lông có chân của người được lấy mẫu.

Bước 5. Gói mẫu trong giấy sạch, để vào phong bì đựng mẫu.

Bước 6: Lập Biên bản thu mẫu .

Bước 7: Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý: Không để phần chân tóc chạm vào găng tay hay bất cứ một bề mặt nào khác.

1.3. Thu mẫu tế bào niêm mạc miệng

Bước 1: Xác nhận nhân thân người được lấy mẫu qua giấy tờ tùy thân (Giấy chứng minh nhân dân, Căn cước công dân, Hộ chiếu…), ghi đầy đủ thông tin lên phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh người được lấy mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu…

Bước 4. Người được lấy mẫu súc miệng thật kỹ (3-5 lần) bằng nước sạch.

Bước 5. Dùng đầu tăm bông vô trùng vừa chà vừa xoay tròn phía trong má (trong miệng) lên và xuống khoảng 1 phút. Dùng hai tăm bông cho má bên trái và hai tăm bông cho má bên phải. Để các tăm bông đã thu mẫu vào phong bì đã ghi thông tin của người được lấy mẫu.

Bước 6. Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15phút, sau đó cho vào phong bì đựng mẫu (không đựng mẫu trực tiếp trong túi nilon hoặc hộp kín).

Bước 7: Lập Biên bản thu mẫu .

Bước 8. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý: Không chạm đầu tăm bông dùng để thu mẫu vào găng tay hay bất cứ một bề mặt nào khác (cả trước và sau khi thu mẫu).

1.4. Thu mẫu móng tay/chân

Bước 1: Xác nhận nhân thân người được lấy mẫu qua giấy tờ tùy thân (Giấy chứng minh nhân dân, Căn cước công dân, Hộ chiếu…), ghi đầy đủ thông tin lên phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh người được lấy mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu…

Bước 4. Vệ sinh móng tay/chân thật kỹ bằng nước sạch hoặc cồn sát khuẩn.

Bước 5. Dùng dụng cụ cắt móng cắt từ 3 đến 4 móng tay (chân) của người được lấy mẫu.

Bước 6. Để mẫu móng tay, móng chân vào phong bì đựng mẫu.

Bước 7: Lập Biên bản thu mẫu.

Bước 8. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý: Chỉ thu mẫu móng tay/móng chân để giám định ADN khi không thể thu được các loại mẫu máu/tóc/tế bào niêm mạc miệng.

1.5. Thu mẫu mô

Bước 1: Ghi thông tin của mẫu bên ngoài phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ thu mẫu …

Bước 3: Dùng kéo hoặc dao mổ thu mẫu mô (khoảng 0,1 – 0,2 cm2).

Bước 6. Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng (hoặc sấy ở nhiệt độ 30 – 35^oC), cho vào phong bì đựng mẫu.

Bước 7: Lập Biên bản thu mẫu.

Bước 8. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý: Mẫu mô sử dụng xét nghiệm ADN phải chưa bị phân hủy.

1.6. Thu mẫu xương/răng

– Đối với tử thi: Tùy trường hợp thu một trong các mẫu sau

• Thu mẫu xương, sụn (1 – 2cm), làm sạch, khô mẫu, cho vào phong bì đựng mẫu (hoặc ống falcon/ lọ nhựa sạch). Ghi đầy đủ thông tin bên ngoài vật đựng mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, tên vụ việc liên quan đến tử thi được thu mẫu.
• Thu mẫu răng (2 chiếc răng). Làm sạch, khô mẫu, cho vào phong bì đựng mẫu (hoặc ống falcon/ lọ nhựa sạch). Ghi đầy đủ thông tin bên ngoài vật đựng mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, tên vụ việc liên quan đến tử thi được thu mẫu.

–    Đối với hài cốt:

• Mẫu răng: Lấy từ 03 chiếc răng trở lên (Yêu cầu: Răng chắc, còn chân răng), cho vào phong bì đựng mẫu (hoặc ống falcon/ lọ nhựa sạch). Ghi đầy đủ thông tin bên ngoài vật đựng mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, ghi tên vụ việc liên quan đến hài cốt được thu mẫu.
• Mẫu xương: Lấy đoạn ở giữa xương ống chân (tay) dài khoảng 5 cm, (Yêu cầu: Xương chắc), cho vào phong bì đựng mẫu (hoặc ống falcon/ lọ nhựa sạch). Ghi đầy đủ thông tin bên ngoài vật đựng mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, ghi tên vụ việc liên quan mẫu được thu.
• Lập Biên bản thu mẫu .

– Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định (Trường hợp thời gian chờ giám định: trên 1 tháng cần bảo lạnh ở 2-8^oC; trên 1 năm cần bảo ở nhiệt độ âm 20^oC).

1.7. Thu mẫu vật chứng

Bước 1. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị hộp giấy hoặc phong bì to đựng mẫu.

Bước 2: Chụp ảnh mẫu.

Bước 3: Làm khô mẫu (Nếu mẫu vật dạng vải, giấy, sợi…):

Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng (hoặc dùng máy sấy tóc sấy ở mức độ nhẹ nhất) đến khi mẫu khô hoàn toàn.

Bước 4. Gói mẫu bằng giấy sạch rồi cho vào hộp giấy đóng niêm phong. Bên ngoài hộp giấy ghi rõ đầy đủ thông tin về mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, ghi tên vụ việc liên quan đến mẫu.

Bước 6. Lập Biên bản thu và niêm phong mẫu.

Bước 7. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định (Trong trường hợp mẫu chưa khô hoàn toàn cần bảo quản lạnh âm 20⁰C đến khi giám định).

1.8. Thu mẫu vết sinh học tại hiện trường

Bước 1: Ghi thông tin của mẫu bên ngoài phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh vị trí thu mẫu trước khi thu mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ thu mẫu …

Bước 4. Thu mẫu như sau:

Dùng tăm bông phết tại vết sinh học nghi ngờ (vết máu, tinh dịch, vv…) trong trường hợp mẫu vết rõ ràng trên bề mặt không thể đưa trực tiếp đến cơ quan giám định (trên mặt đất, cột nhà bằng sắt/thép …). Nếu mẫu vết đã khô, dùng tăm bông thấm 01 giọt nước cất đã khử trùng trước khi phết.

Bước 5. Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút, sau đó cho mẫu vào trong phong bì đựng mẫu.

Bước 6. Lập Biên bản thu mẫu.

Bước 7. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý:

Tìm và thu vết sinh học phải được tiến hành kịp thời, thận trọng, tỉ mỉ với sự trợ giúp của các phương tiện kỹ thuật chuyên dụng. Có thể sử dụng các Kit thu mẫu chuyên dụng, tham khảo hướng dẫn của nhà sản xuất.

1.9. Nhận, bảo quản mẫu giám định

– Đeo găng tay, khẩu trang.

– Ghi nhận tình trạng bảo quản mẫu.

– Kiểm tra niêm phong.

– Chụp ảnh mẫu còn nguyên niêm phong.

– Mở niêm phong.

– Kiểm tra mẫu: loại mẫu, số lượng mẫu, tình trạng mẫu.

– Chụp ảnh mẫu.

– Lập biên bản:

+ Biên bản giao nhận mẫu theo qui định (Trường hợp mẫu do cơ quan trưng cầu, người yêu cầu mang đến).

+ Biên bản mở niêm phong mẫu theo qui định (Trường hợp mẫu do cơ quan trưng cầu, người yêu cầu gửi qua đường bưu điện).

– Tùy theo tình trạng mẫu chọn phương pháp bảo quản ở nhiệt độ phòng hay nhiệt độ lạnh.

2. Chuẩn bị mẫu

Tùy theo từng loại mẫu sử dụng các bước như sau:

2.1. Mẫu máu

Cắt khoảng 0,2- 0,5 cm² vết máu khô thành từng mảnh nhỏ cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

2.2. Mẫu chân lông/tóc

Cắt 1-2 chân lông/tóc cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

2.3. Mẫu tế bào niêm mạc miệng

Tách phần ngoài đầu tăm bông cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

2.4. Mẫu móng tay/móng chân

+ Dùng dao cạo sạch những chất bẩn trên móng tay/chân.

+ Dùng tăm bông thấm cồn lau sạch nhiều lần móng tay/chân, sau đó để khô tự nhiên.

+ Cắt nhỏ mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml sạch, sau đó rửa mẫu từ 2 – 3 lần bằng nước deion đã khử trùng.

2.5.  Mẫu mô

Cắt mẫu mô khoảng 0,05 mm² cho vào ống ly tâm 1,5 ml sạch, sau đó rửa mẫu từ 2 – 3 lần bằng nước deion đã khử trùng.

2.6. Mẫu xương/răng

* Làm sạch bằng cơ học

– Làm sạch bên ngoài mẫu xương/răng bằng cơ học.

– Đối với mẫu xương, cưa nhỏ thành các miếng khoảng 1 cm², mài sạch phần đã phân hủy bên ngoài và bên trong ống xương bằng máy mài.

* Làm sạch bằng hoá chất

– Rửa xương/răng bằng Natri hypoclorit 1% – 5%, trong 20 – 40 giây (tùy theo chất lượng mẫu).

– Rửa lại bằng nước khử ion vô trùng, không chứa ADN (lặp lại 3 lần).

– Ngâm mẫu xương/răng trong Ethanol 100% trong 10 phút.

– Để khô mẫu xương/răng ở nhiệt độ phòng, trong 3 – 5 giờ (hoặc cho đến khi mẫu khô hoàn toàn).

* Nghiền mẫu xương/răng

– Nghiền xương/răng bằng máy nghiền chuyên dụng sử dụng trong phòng thí nghiệm.

– Lấy ≤ 100 mg bột xương/răng đã nghiền vào ống ly tâm 15 ml.

2.7. Mẫu vết sinh học là mẫu tinh dịch thu trong âm đạo, mẫu mẫu tinh trùng lẫn tế bào biểu mô, mẫu tinh trùng lẫn máu…

a. Chuẩn bị dung dịch phân giải tế bào

Sử dụng Differex System (Promega – Mỹ)

Bổ sung proteinase K vào dung dịch phân giải tế bào (Digestion Buffer) để nồng độ cuối đạt 270 µg/ml. Mỗi mẫu cần sử dụng 0,4 ml dung dịch phân giải tế bào. Trộn đều và sử dụng ngay.

b. Phân tách tế bào tinh trùng từ mẫu lẫn với các loại tế bào khác

Bước 1: Cho mẫu vào ống ly tâm.

Bước 2: Bổ sung 0,4 ml dung dịch phân giải tế bào đã chuẩn bị ở phần a vào mỗi mẫu.

Bước 3: Đậy nắp, trộn mẫu bằng máy vortex ở tốc độ cao trong 30 giây. Giữ ống thẳng trong quá trình trộn mẫu. Đặt ống vào máy ủ ở nhiệt độ 56⁰C trong 1 giờ hoặc để ở 37⁰C trong 2 giờ.

Bước 4: Hút 100 ml dung dịch phân tách (Separation Solution) vào một ống ly tâm sạch, đặt DNA IQ™ Spin Basket lên phía trên của ống ly tâm.

Bước 5: Sau khi phân giải tế bào bằng proteinase K ở bước 3, loại bỏ phần vật chất cứng từ mẫu vật, dùng pipet hút và nhả nhẹ nhàng dịch phân giải tế bào sang ống chứa DNA IQ™ Spin Basket đã chuẩn bị ở bước 4.

Bước 6: Đậy nắp và ly tâm ở tốc độ cao nhất (14000 vòng/phút) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ly tâm, ống sẽ chứa một phần nhỏ màu vàng nhạt hoặc màu trắng lắng dưới đáy ống là phần chứa tinh trùng, một phần là dung dịch phân tách (Separation Solution) trong suốt ở phía dưới thấp và trên cùng là phần dung dịch phân giải tế bào (Digestion Solution) màu vàng có chứa ADN từ các loại tế bào không phải là tinh trùng.

Bước 7: Bỏ phần DNA IQ™ Spin Basket. Loại bỏ các giọt dung dịch phân giải tế bào (Digestion Solution) trên nắp ống bằng giấy không bụi (Kimwipes^®) hoặc pipet. Hoặc có thể ly tâm nhanh để toàn bộ các giọt dung dịch phân giải tế bào xuống dưới đáy ống. Đảm bảo không còn dung dịch bám trên nắp sau khi ly tâm để không làm nhiễm các loại tế bào khác vào pha chứa tinh trùng.

Bước 8: Giữ lại một phần dung dịch phân giải dùng cho tách chiết ADN từ các loại tế bào không phải tinh trùng (nếu cần) theo các bước tách chiết ADN ở bước 4.

Bước 9: Hút 500 ml nước vào phía trên của dung dịch phân tách (Separation Solution), rửa phần thân phía trên của ống ly tâm, có thể một phần của dung dịch phân tách sẽ trộn lẫn với nước và không ảnh hưởng đến kết quả.

Bước 10: Đợi 30 giây hoặc lâu hơn, sau đó loại bỏ lớp nước trên cùng với 1/3 phần dung dịch phân tách và các tế bào gần tiếp xúc giữa nước và dung dịch phân tách. Bước rửa này giúp pha loãng và loại bỏ phần chứa ADN từ các loại tế bào không phải tinh trùng. Không được làm ảnh hưởng đến phần tủa chứa tinh trùng phía dưới.

Bước 11: Rửa lần thứ 2 bằng nước tương tự như bước 9 và 10.

Bước 12: Sau quá trình phân tách tế bào, phần kết tủa thu được ở dưới đáy ống ly tâm (là phần chứa tinh trùng) được ủ theo kit tách chiết ở phần 2.

Chú ý: Có thể sử dụng các kit thương mại khác và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.8. Các mẫu vết sinh học khác

Sử dụng một trong các cách sau:

– Cắt trực tiếp vào vật mang vết mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

– Dùng tăm bông chuyên dụng phết vết mẫu, cắt phần bông cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

– Dùng băng dính chuyên dụng (sản phẩm thương mại được thiết kế đặc biệt chuyên dùng cho thu mẫu vết phục vụ giám định ADN) thu mẫu vết, cho băng dính ống thu được cung cấp kèm theo băng dính.

(Chú ý: Có thể sử dụng các kit thu mẫu chuyên dụng khác).

3. Tách chiết ADN

3.1. Tách chiết ADN từ mẫu máu, chân tóc, niêm mạc miệng

Bước 1: Bổ sung 1 ml đệm PBS vào ống ly tâm đã đựng mẫu, vortex 5 – 10 giây, ly tâm nhanh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

Bước 2. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 3. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn. (Lặp lại các bước 1, 2, 3 thêm 2 lần để làm sạch mẫu).

Bước 4. Bổ sung 150 – 200 µl dung dịch Chelex^®100 10%, 10 – 15 µl dung dịch proteinase K (10 mg/ml).

Bước 5: Ly tâm nhanh.

Bước 6. Ủ mẫu trong máy lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 56°C trong 30 – 60 phút.

Bước 7. Ủ mẫu trong máy lắc ổn nhiệt ở 100°C trong 5 phút.

Bước 8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, hút dịch nổi sang ống ly tâm 1,5 ml mới và bảo quản ở nhiệt độ -20°C nếu chưa sử dụng ngay.

Chú ý: Tách chiết ADN bằng các bộ hóa chất khác cần tham khảo thêm hướng dẫn của nhà sản xuất.

3.2. Tách chiết ADN từ mẫu móng tay/chân, mẫu mô, mẫu vết sinh học

Sử dụng QIAamp^® DNA Micro Kit (Qiagen – Đức).

Bước 1: Bổ sung 180 ml đệm ATL và 20 ml proteinase K (20mg/ml) vào ống ly tâm chứa mẫu, trộn đều bằng máy vortex 15 giây.

Bước 2: Cho ống ly tâm vào máy lắc ổn nhiệt ủ ở 56^oC, trong 2 – 4 giờ hoặc qua đêm.

Bước 3: Bổ sung 200 ml đệm AL, trộn đều bằng máy vortex 15 giây.

Bước 4: Bổ sung 200 ml Ethanol (96-100%), vortex kỹ khoảng 15 giây, để ở nhiệt độ phòng (15 – 25^o C) trong 5 phút.

Bước 5: Ly tâm nhanh.

Bước 6: Chuyển toàn bộ dung dịch ly giải sang cột QIAamp^® MinElute (trong ống 2 ml). Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Đặt cột sang ống 2 ml mới. Bỏ ống chứa dịch.

Bước 7: Bổ sung 500 ml đệm AW1. Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Đặt cột sang ống 2 ml mới. Bỏ ống chứa dịch.

Bước 8: Bổ sung 500 ml đệm AW2. Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Đặt cột sang ống 2 ml mới. Bỏ ống chứa dịch.

Bước 9: Ly tâm 14000 vòng/ phút trong 3 phút để màng khô hoàn toàn.

Bước 10:  Đặt cột vào ống ly tâm 1,5 ml. Bỏ ống chứa dịch. Cho thêm từ 20 -100 ml dung dịch AE vào giữa màng lọc.

Bước 11: Đậy nắp, để ở nhiệt độ phòng (15 – 25^oC) trong 1- 5 phút. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút.

Bước 12:. Thu dịch chứa ADN và bảo quản ở – 20^oC.

Chú ý: Tách chiết ADN với các bộ hóa chất khác cần tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất.

3.3. Tách chiết ADN từ mẫu xương/răng

Sử dụng QIAamp^® DNA Investigator kit (Qiagen – Đức).

Bước 1: Lấy ≤ 100 mg bột xương/răng đã nghiền vào ống ly tâm 15 ml. Bổ sung 360 µl ATL và thêm 20 µl proteinase K. Ủ qua đêm ở 56^oC.

Bước 2: Ly tâm nhanh.

Bước 3: Thêm 300 µl đệm AL, đóng nắp, trộn đều bằng máy vortex trong 10 giây.

Bước 4: Ủ 70^oC, lắc ở 900 vòng/phút trong 10 phút trong máy lắc ổn nhiệt.

Bước 5: Ly tâm tốc độ cao (20.000 x g hoặc 14.000 vòng/phút) trong 1 phút, và hút dịch nổi sang ống ly tâm 1,5 ml mới.

Bước 6: Thêm 150 ml Ethanol (96% – 100%). Đóng nắp lại, trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây.

Bước 7: Ly tâm nhanh.

Bước 8: Chuyển toàn bộ dịch ở phân giải sau bước 7 lên cột QIAamp^® MinElute (trong ống thu 2 ml) một cách cẩn thận, không làm dính ướt lên mép cột.

Bước 9: Đóng nắp, ly tâm 6000 x g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp MinElute sang ống thu 2 ml mới. Bỏ ống thu có chứa dịch qua cột.

Bước 10: Mở nắp cột QIAamp MinElute một cách cẩn thận, bổ sung 600 µl đệm AW1 mà không làm ướt mép cột, ly tâm 6000 x g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp MinElute sang ống thu mới. Bỏ ống thu có chứa dịch qua cột.

Bước 11: Mở nắp cột QIAamp MinElute một cách cẩn thận, bổ sung 700 µl đệm AW2 mà không làm ướt mép cột. Ly tâm 6000 x g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp Minelute sang ống thu mới. Bỏ ống thu có chứa dịch qua cột.

Bước 12: Mở nắp cột QIAamp MinElute một cách cẩn thận, bổ sung 700 µl Ethanol (96-100%) mà không làm ướt mép cột. Ly tâm 6000 x g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp Minelute sang ống thu 2 ml mới, bỏ ống thu có chứa dịch qua cột.

Bước 13: Ly tâm ở tốc độ cao (20.000 x g; 14.000 vòng/phút ) trong 3 phút để làm khô màng hoàn toàn.

Bước 14: Chuyển cột QIAamp Minelute sang ống ly tâm 1,5 ml và bỏ ống thu có chứa dịch qua cột. Mở nắp cột QIAamp Minelute, ủ nhiệt độ phòng (15 -25^oC) trong 10 phút hoặc ở 56^oC trong 3 phút.

Bước 15: Bổ sung 20 – 50 µl đệm AE hoặc nước cất (yêu cầu nước không chứa ADN) vào giữa màng.

Bước 16: Đậy nắp và để nhiệt độ phòng (15 -25^oC) trong 1 – 5 phút. Ly tâm ở tốc độ cao (20.000 x g; 14.000 vòng/phút) trong 1 phút.

Bước 17: Thu dịch chứa ADN và bảo quản ở nhiệt độ -20^oC.

Chú ý: Tách chiết ADN bằng các kit hóa chất khác cần tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất.

4. Định lượng ADN

Sử dụng hóa chất Quantifiler^TM Trio DNA Quantification kit (ABI) trên máy Realtime PCR 7500.

 Xây dựng đường chuẩn

• Pha dãy chuẩn: Pha loãng mẫu chuẩn Quantifiler™ THP DNA Standard thành các nồng độ khác nhau theo hướng dẫn trong bảng dưới.

 

Tên mẫu chuẩn	Nồng độ (ng/µl)	Tỷ lệ pha
Std.1	50.000	10 µl [100 ng/µl stock] + 10 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer
Std.2	5.000	10 µl [Std.1] + 90 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer
Std.3	0.500	10 µl [Std. 2] + 90 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer
Std.4	0.050	10 µl [Std. 3] + 90 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer
Std.5	0.005	10 µl [Std. 4] + 90 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer

 

Chuẩn bị phản ứng PCR

• Thành phần mỗi phản ứng gồm:

Quantifiler™ Trio Primer Mix: 8 µl

Quantifiler™ THP PCR Reaction Mix: 10 µl

ADN: 2 µl

• Chu trình nhiệt

Nhiệt độ	Thời gian	Chu kỳ
90oC	2 phút
95oC	9 giây	40 chu kỳ
60oC	30 giây

 

Chạy trên máy 7500 Real-Time PCR như hướng dẫn trong bộ kit của nhà sản xuất.

Phân tích dữ liệu

Dựa vào bảng số liệu để phân tích từng chỉ số và đưa ra nồng độ mẫu đầu vào thích hợp cho các phản ứng PCR tiếp theo.

Chú ý: Tùy thuộc vào điều kiện phòng thí nghiệm có thể sử dụng các phương pháp định lượng ADN tổng số bằng máy đo OD, điện di trên gel agarose hoặc một số phương pháp khác nhưng kết quả định lượng không cho độ chính xác cao như phương pháp Real time PCR.

5. Thực hiện phản ứng PCR

Tùy theo mục đích xét nghiệm thực hiện PCR theo một trong các phương pháp sau đây:

5.1. Xác định mối quan hệ huyết thống bố/ mẹ – con, truy nguyên cá thể

 Sử dụng PowerPlex^® Fusion System Kit (hãng Promega – Mỹ) phân tích 24 locus STR trên nhiễm sắc thể thường.

– Thành phần phản ứng PCR

 

Thành phần/1 mẫu	Thể tích
PowerPlex® Fusion 5X Master Mix	5 µl
PowerPlex® Fusion 5X Primer Pair Mix	5 µl
ADN (10 ng)	Tối đa 15 µl
Nước deion vô trùng, không chứa ADN	Thêm nước để tổng thể tích phản ứng là 25 µl

• Chu trình nhiệt PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
960C	1 phút	1 chu kỳ
940C	10 giây	27 chu kỳ
590C	1 phút
720C	30 giây
600C	20 phút	1 chu kỳ
40C	Giữ nhiệt	∞

 

Chú ý: Có thể sử dụng các bộ hóa chất của các nhà sản xuất khác, tham khảo hướng dẫn của từng bộ hóa chất.

Yêu cầu: Sử dụng các bộ hóa chất để xác định huyết thống bố/mẹ – con phải phân tích từ 24 locus STR trở lên và có chứng chỉ ISO 18385/Forensic-Grade hoặc tương đương.

5.2. Xác định mối quan hệ huyết thống theo dòng cha

Sử dụng PowerPlex^® Y23 System kit (Promega – Mỹ) phân tích 23 locus STR trên nhiễm sắc thể Y.

– Thành phần phản ứng PCR:

Thành phần	Thể tích
PowerPlex® Y23 5X Master Mix	5µl
PowerPlex® Y23 10X Primer Pair Mix	2.5 µl
ADN (0.5 ng)	Tối đa 17.5 µl
Nước deion vô trùng, không chứa ADN	Thêm nước để tổng thể tích phản ứng là 25 µl

– Chu trình nhiệt PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
960C	2 phút	1 chu kỳ
940C	10 giây	30 chu kỳ
610C	1 phút
720C	30 giây
600C	20 phút	1 chu kỳ
40C	Giữ nhiệt	∞

 

Chú ý: Có thể sử dụng các bộ hóa chất của các nhà sản xuất khác, tham khảo hướng dẫn của từng bộ hóa chất.

Yêu cầu: Sử dụng các bộ hóa chất để phân tích các locus STR trên nhiễm sắc thể Y phải phân tích từ 23 locus STR trở lên và có chứng chỉ ISO 18385/Forensic-Grade hoặc tương đương.

5.3. Xác định mối quan hệ huyết thống theo nhiễm thể X (bà nội – cháu gái, chị – em gái cùng cha)

Sử dụng Investigator Argus X-12 QS Kit (Qiagen – Đức) phân tích 12 locus STR trên nhiễm sắc thể X

– Thành phần PCR

Thành phần phản ứng PCR	Thể tích
Fast Reaction Mix 2.0	7.5 µl
Primer Mix	2.5 µl
ADN khuôn (0.2 – 2 ng)	Tối đa 15 µl
Nước deion	Điều chỉnh vừa đủ tổng thể tích là 25 µl

– Chu trình nhiệt PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
98oC 61oC 72oC	30 giây 120 giây 75 giây	3 chu kỳ
96oC 61oC 72oC	30 giây 120 giây 75 giây	27 chu kỳ
68oC	2 phút	1 chu kỳ
10oC	∞

 

Chú ý: Có thể sử dụng các bộ hóa chất của các nhà sản xuất khác, tham khảo hướng dẫn của từng bộ hóa chất.

Yêu cầu: Sử dụng các bộ hóa chất để phân tích các locus STR trên nhiễm sắc thể X phải phân tích từ 12 locus STR trở lên và có chứng chỉ ISO 18385/Forensic-Grade hoặc tương đương.

6. Chạy điện di mao quản trên máy 3500 Genetic Analyzer (Theomo Fisher scientific – Mỹ)

Tùy từng bộ kit sử dụng các phương pháp như sau:

6.1. PowerPlex^® Fusion System Kit và PowerPlex^® Y23 System kit (Promega – Mỹ)

Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch Wen ILS500 và Hidi formamide cho n mẫu như sau:

[(0.5µl WEN ILS500/ WEN ILS500 Y23) x (n mẫu)] + [(9.5µl Hidi formamide) x (n mẫu)].

Bước 2: Vortex từ 10 – 15 giây

Bước 3: Hút 10µl dung dịch đã chuẩn bị ở bước 1 cho vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng (96 well plate).

Bước 4: Bổ sung 1 µl mẫu (sản phẩm sau PCR) vào từng giếng và 1 µl allelic ladder vào giếng chạy thang chuẩn. Đậy nắp cao su (Septa) lên trên đĩa chạy.

Bước 5: Ly tâm nhanh đĩa.

Bước 6: Sốc nhiệt ở 95⁰C trong 3 phút và chuyển đĩa ngày vào giá để giữ lạnh trong 3 phút.

Bước 7: Chuyển đĩa vào máy điện di mao quản chạy chương trình theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ghi chú: Mỗi lần chạy mẫu phải kèm theo thang chuẩn (Allelic ladder thay cho mẫu).

6.2. Investigator Argus X-12 QS Kit (Qiagen – Đức)

Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch Hidi Formamide và DNA Size Standard 550 (BTO) theo tỷ lệ như sau:

[(12µl Hidi formamide) x (n mẫu)] + [(0.5 µl BTO) x (n mẫu)]

Bước 2: Hút 12 µl dung dịch chuẩn bị ở bước 1 vào mỗi giếng của đĩa chạy mẫu.

Bước 3: Bổ sung 1 µl mẫu (sản phẩm sau PCR) vào mỗi giếng và 1 µl allelic ladder vào giếng chạy thang chuẩn. Đậy nắp cao su (Septa) kín đĩa chạy.

Bước 4: Sốc nhiệt ở 95⁰C trong 3 phút sau đó cho ngay vào giá để giữ lạnh trong 3 phút.

Bước 5: Đưa đĩa vào máy chạy điện di mao quản chạy chương trình đã được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

7. Đọc dữ liệu

– Đọc dữ liệu sau khi chạy điện di mao quản bằng phần mềm GeneMapper^® ID-X.

– Xuất file PDF profile ADN (dữ liệu ADN thu được ở dạng các đỉnh xác định các alen) của từng mẫu lưu, kết quả bằng file mềm và in bản cứng lưu hồ sơ.

8. Tính toán độ tin cậy trong xét nghiệm huyết thống cha/mẹ – con

– Theo Định luật Mendel, các alen nằm trên NST thường được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác theo quy luật: Con sẽ nhận 1 alen từ bố và 1 alen từ mẹ.

– Tính tỷ suất tương đồng (Likehood ratio – LR) của từng locus gen tuân theo Định lý Bayes: Cho phép tính xác suất xảy ra của một sự kiện ngẫu nhiên A khi biết sự kiện liên quan B đã xảy ra. Xác suất này được ký hiệu là P(A|B), và đọc là “xác suất của biến cố A nếu biến cố B đã xảy ra”. Đại lượng này được gọi xác suất có điều kiện hay xác suất hậu nghiệm vì nó được rút ra từ giá trị được cho của B hoặc phụ thuộc vào giá trị đó.

LR=

Trong đó:

–  Pr (E|H­_p) là xác suất kiểu gen của đứa trẻ được di truyền từ người mẹ và người cha thực sự.

– Pr (E|H­_d) là xác suất kiểu gen của đứa trẻ được di truyền từ người mẹ và người cha không phải là cha đẻ nhưng có kiểu gen giống với cha đẻ.

– Tính tỷ suất tương đồng kết hợp (Combined Relationship Index – CRI) bằng tích LR của các locus. Dựa vào giá trị CRI để xác định độ tin cậy của kết luận có quan hệ huyết thống giữa hai hồ sơ ADN.

– Tính xác suất có quan hệ huyết thống hay còn gọi là chỉ số có quan hệ cha con (Combined Paternity Index – CPI) theo công thức:

CPI =

Trong đó Pr (Prior Probability) là xác suất ưu tiên và được giới hạn từ 0 – 1 (thường chọn là 0.5).

9.  Kết luận

Kết luận giám định căn cứ vào nội dung trưng cầu, yêu cầu giám định của cơ quan trưng cầu, người yêu cầu giám định và dựa trên kết quả phân tích.

1. HOÀN THÀNH, TRẢ KẾT QUẢ, LƯU TRỮ HỒ SƠ GIÁM ĐỊNH
2. Hoàn thành kết luận giám định

– Giám định viên hoàn thiện bản kết luận giám định trước khi trình lãnh đạo đơn vị duyệt. (Bản kết luận theo mẫu quy định)

– Giám định viên duyệt và ký bản chính thức kết luận giám định

– Lãnh đạo đơn vị ký bản kết luận giám định.

– Đóng dấu bản kết luận giám định.

2. Trả kết luận giám định

– Trả bản Kết luận giám định, kèm theo toàn bộ mẫu còn lại sau khi giám định (nếu có):

+ Trả trực tiếp cho cơ quan trưng cầu/người yêu cầu giám định: Có biên bản giao nhận kết quả giám định.

+ Trả theo đường bưu chính theo hình thức gửi đảm bảo và có ký giao, nhận giữa các bên.

3. Lưu hồ sơ giám định

– Toàn bộ hồ sơ giám định được thiết lập, lưu tại cơ quan giám định theo quy định chung và quy định của cơ quan giám định

4. Lưu mẫu sau giám định

– Các mẫu còn lại sau khi giám định được lưu giữ ở nhiệt 25⁰C, độ ẩm dưới 50% (đối với mẫu khô), hoặc âm 20⁰C (đối với mẫu chưa khô) trong thời gian chờ bàn giao lại cho cơ quan trưng cầu giám định.

– Các trường hợp thời gian lưu giữ mẫu trên 6 tháng, Cơ quan trưng cầu cần chi trả phí lưu giữ mẫu cho cơ quan giám định.

5. Lưu giữ mẫu ADN sau giám định

Lưu giữ mẫu ADN sau giám định ở nhiệt độ -20^oC/-40^oC/-80^oC.

Mẫu ADN được lưu giữ trong vòng 06 tháng sau khi ban hành kết luận giám định.

 

Mẫu số …/QTGĐ

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH ADN TY THỂ

 

I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI ÁP DỤNG

1. Đối tượng

Giám định ADN ty thể từ các mẫu sinh học: máu, lông, tóc, niêm mạc miệng, mô, móng, dịch sinh học, dấu vết…

1.     Phạm vi áp dụng

          Quy trình giám định quy định điều kiện, thủ tục, trình tự và các phương pháp giám định ADN ty thể từ các mẫu sinh học.

Áp dụng cho các tổ chức, cá nhân thực hiện giám định ADN theo trưng cầu /yêu cầu của các tổ chức, cá nhân trong phạm vi cả nước.

1. ĐIỀU KIỆN VỀ NHÂN LỰC, CƠ SỞ VẬT CHẤT, TRANG THIẾT BỊ GIÁM ĐỊNH
2. Nhân lực

– Giám định viên (GĐV): Là người được đào tạo ngành/chuyên ngành sinh học hoặc công nghệ sinh học hoặc Y sinh học di truyền…, đã được bổ nhiệm giám định viên.

– Người giúp việc (NGV) cho giám định viên: là cán bộ chuyên môn của đơn vị được thủ trưởng đơn vị phân công.

– Số lượng GĐV và NGV như sau:

+ Giám định lần đầu: 02 GĐV; 02 NGV.

+ Giám định lại: 03 GĐV; 03 NGV.

+ Giám định lại lần thứ hai: 03 GĐV theo danh sách trong Quyết định thành lập Hội đồng giám định lại lần thứ hai của Bộ trưởng Bộ Y tế và 03 NGV.

+ Trường hợp hội chẩn: Các GĐV và các chuyên gia. Tùy từng trường hợp giám định có thể mời chuyên gia nhưng không quá 07 người.

2. Cơ sở vật chất

Phòng xét nghiệm: Phòng phát hiện dấu vết, phòng tách chiết, phòng PCR, phòng điện di, … Các phòng xét nghiệm đảm bảo sạch sẽ, độc lập, tách biệt để kiểm soát nhiễm trong quá trình thao táo, thực hiện các khâu giám định ADN.

3. Trang thiết bị, hóa chất, vật tư

– Trang thiết bị: Hệ thống phát hiện dấu vết, máy PCR, máy RT-PCR, hệ thống điện di mao quản và các thiết bị phụ trợ khác.

– Trang thiết bị: Hệ thống phát hiện dấu vết, hệ thống điện di giải trình tự gen, máy giải trình tự gen thế hệ mới (NGS), máy luân nhiệt (PCR), máy Realtime PCR, các loại máy ly tâm, máy lắc ổn nhiệt, máy trộn vortex, máy điện di, tủ lạnh, tủ lạnh âm các mức nhiệt độ khác nhau, cân điện tử, máy khuất từ gia nhiệt, tủ tách chiết ADN, tủ PCR, các loại pipet và các thiết bị phụ trợ khác.

– Hóa chất: Các bộ kit dùng cho tách chiết ADN, PCR, điện di, giải trình tự, các loại hóa chất khác cần thiết cho từng công đoạn phân tích.

– Vật tư tiêu hao: Các loại ống ly tâm, đầu côn, găng tay, khẩu trang, quần áo bảo hộ, kính bảo hộ, cồn, vv…

III. TIẾP NHẬN HỒ SƠ, PHÂN CÔNG GIÁM ĐỊNH

1. Tiếp nhận hồ sơ

– Cán bộ được giao nhiệm vụ tiếp nhận và lập biên bản giao nhận quyết định trưng cầu/ yêu cầu, hồ sơ giảm định. Hồ sơ giám định do cơ quan trưng cầu/người yêu cầu giám định cung cấp trực tiếp hoặc gián tiếp qua bưu điện. Hồ sơ gửi giám định, gồm:

– Quyết định trưng cầu, yêu cầu giám định hợp pháp.

– Các tài liệu khác có liên quan.

• Nếu hồ sơ đủ điều kiện giám định hoặc hồ sơ cần bổ sung, cán bộ được phân công vào sổ theo dõi và báo cáo lãnh đạo đơn vị để thực hiện tiếp các bước tiếp theo của quy trình này.
• Nếu hồ sơ không đủ điều kiện giám định, cán bộ được phân công báo cáo lãnh đạo đơn vị ra văn bản từ chối giám định trong trường hợp:

+ Hồ sơ không đủ tính pháp lý.

+ Yêu cầu về hồ sơ của cơ quan giám định không được đáp ứng.

+ Nội dung trưng cầu/yêu cầu giám định vượt quá khả năng về chuyên môn, cán bộ, phương tiện, thời gian.

+ Người được giám định (nếu có) khác với người trong hồ sơ giám định.

+ Người được giám định (nếu có) không hợp tác.

+ Không có người giám hộ trong trường hợp quy định bắt buộc.

+ Không đảm bảo về an ninh trong khi thi hành nhiệm vụ.

• Nếu từ chối giám định:

+ Từ chối giám định bằng văn bản, nêu rõ lý do.

+ Trả hồ sơ cho cơ quan trưng cầu/người yêu cầu giám định theo quy định.

2. Phân công giám định

– Căn cứ loại mẫu, chỉ tiêu, lĩnh vực giám định, năng lực của giám định viên, người phụ trách phân công mẫu cho nhóm giám định gồm các giám định viên và người giúp việc để tiến hành giám định.

– Số lượng giám định viên và người giúp việc như sau:

+ Giám định lần đầu: 2 giám định viên; 2 người giúp việc.

+ Giám định lại: 3 giám định viên; 3 người giúp việc.

– Mẫu giao cho các nhóm giám định phải ghi đầy đủ các thông tin của mẫu, ngày giao mẫu, tên của nhóm nhận mẫu vào sổ.

– Sau khi nhận mẫu, nhóm giám định có trách nhiệm tiến hành giám định và ghi lại quá trình giám định theo quy định.

– Nhiệm vụ của GĐV:

+ Các GĐV được phân công nghiên cứu hồ sơ, tài liệu trước khi khám giám định.

+ Liên hệ và trao đổi với đại diện cơ quan trưng cầu và các cơ quan có liên quan.

+ Chỉ đạo NGV chuẩn bị dụng cụ, trang thiết bị để giám định.

+ Trực tiếp phân tích mẫu giám định: chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN, định lượng ADN, PCR, điện di, tính toán xác suất…

+ Các GĐV giám sát, phối hợp với nhau trong quá trình giám định, đối chiếu kết quả, cùng nhau thảo luận, thống nhất trước khi kết luận giám định.

+ Hoàn thiện văn bản ghi nhận quá trình giám định và kết luận giám định.

+ Giải quyết những phát sinh trong quá trình giám định, báo cáo kết quả với lãnh đạo cơ quan.

– Nhiệm vụ của NGV:

+ Chuẩn bị dụng cụ, trang thiết bị, phương tiện bảo hộ.

+ Phụ giúp GĐV trong quá trình phân tích mẫu giám định: chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN, định lượng ADN, PCR, điện di,…

+ Chụp ảnh mẫu giám định.

+ Vệ sinh dụng cụ, thiết bị, phương tiện.

+ Bảo quản mẫu xét nghiệm, mẫu tồn dư, bàn giao mẫu giám định.

+ Phụ giúp GĐV dự thảo văn bản ghi nhận quá trình giám định và kết luận giám định, hoàn thiện bản ảnh giám định trình GĐV duyệt.

+ Hoàn thiện hồ sơ giám định.

+ Các nhiệm vụ khác theo phân công của GĐV.

1. GIÁM ĐỊNH

1.2. Thu, nhận mẫu

Tùy từng loại mẫu áp dụng các phương pháp thu mẫu theo các mục sau:

1.1. Thu mẫu máu

Bước 1: Xác nhận nhân thân người được lấy mẫu qua giấy tờ tùy thân (Giấy chứng minh nhân dân, Căn cước công dân, Hộ chiếu…), ghi đầy đủ thông tin lên phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh người được lấy mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu…

Bước 4. Dùng bông y tế đã tẩm cồn lau sạch vị trí lấy mẫu.

Bước 5. Lấy máu bằng dụng cụ lấy mẫu chuyên dụng (Kim tiêm, kim chích máu…).

Bước 6. Thấm lấy từ 2-3 giọt máu lên thẻ lấy mẫu/ gạc/ tăm bông vô trùng.

Bước 7. Sát trùng lại bằng bông cồn tại vị trí lấy mẫu.

Bước 8. Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó cho vào phong bì đựng mẫu (không đựng mẫu trong túi nilon hoặc hộp kín).

Bước 9: Lập Biên bản thu mẫu .

Bước 10. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

1.2. Thu mẫu lông/tóc

Bước 1: Xác nhận nhân thân người được lấy mẫu qua giấy tờ tùy thân (Giấy chứng minh nhân dân, Căn cước công dân, Hộ chiếu…), ghi đầy đủ thông tin lên phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh người được lấy mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu…

Bước 4. Dùng tay hoặc kẹp nhổ từ 5 đến 10 sợi tóc/lông có chân của người được lấy mẫu.

Bước 5. Gói mẫu trong giấy sạch, để vào phong bì đựng mẫu.

Bước 6: Lập Biên bản thu mẫu .

Bước 7: Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý: Không để phần chân tóc chạm vào găng tay hay bất cứ một bề mặt nào khác.

1.3. Thu mẫu tế bào niêm mạc miệng

Bước 1: Xác nhận nhân thân người được lấy mẫu qua giấy tờ tùy thân (Giấy chứng minh nhân dân, Căn cước công dân, Hộ chiếu…), ghi đầy đủ thông tin lên phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh người được lấy mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu…

Bước 4. Người được lấy mẫu súc miệng thật kỹ (3-5 lần) bằng nước sạch.

Bước 5. Dùng đầu tăm bông vô trùng vừa chà vừa xoay tròn phía trong má (trong miệng) lên và xuống khoảng 1 phút. Dùng hai tăm bông cho má bên trái và hai tăm bông cho má bên phải. Để các tăm bông đã thu mẫu vào phong bì đã ghi thông tin của người được lấy mẫu.

Bước 6. Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút, sau đó cho vào phong bì đựng mẫu (không đựng mẫu trực tiếp trong túi nilon hoặc hộp kín).

Bước 7: Lập Biên bản thu mẫu .

Bước 8. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý: Không chạm đầu tăm bông dùng để thu mẫu vào găng tay hay bất cứ một bề mặt nào khác (cả trước và sau khi thu mẫu).

1.4. Thu mẫu móng tay/chân

Bước 1: Xác nhận nhân thân người được lấy mẫu qua giấy tờ tùy thân (Giấy chứng minh nhân dân, Căn cước công dân, Hộ chiếu…), ghi đầy đủ thông tin lên phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh người được lấy mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu…

Bước 4. Vệ sinh móng tay/chân thật kỹ bằng nước sạch hoặc cồn sát khuẩn.

Bước 5. Dùng dụng cụ cắt móng cắt từ 3 đến 4 móng tay (chân) của người được lấy mẫu.

Bước 6. Để mẫu móng tay, móng chân vào phong bì đựng mẫu.

Bước 7: Lập Biên bản thu mẫu.

Bước 8. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý: Chỉ thu mẫu móng tay/móng chân để giám định ADN khi không thể thu được các loại mẫu máu/tóc/tế bào niêm mạc miệng.

1.5. Thu mẫu mô

Bước 1: Ghi thông tin của mẫu bên ngoài phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ thu mẫu …

Bước 3: Dùng kéo hoặc dao mổ thu mẫu mô (khoảng 0,1 – 0,2 cm2).

Bước 6. Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng (hoặc sấy ở nhiệt độ 30 – 35^oC), cho vào phong bì đựng mẫu.

Bước 7: Lập Biên bản thu mẫu.

Bước 8. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý: Mẫu mô sử dụng xét nghiệm ADN phải chưa bị phân hủy.

1.6. Thu mẫu xương/răng

– Đối với tử thi: Tùy trường hợp thu một trong các mẫu sau

• Thu mẫu xương, sụn (1 – 2cm), làm sạch, khô mẫu, cho vào phong bì đựng mẫu (hoặc ống falcon/ lọ nhựa sạch). Bên ngoài vật đựng mẫu ghi đầy đủ thông tin: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, tên vụ việc liên quan đến tử thi được thu mẫu.
• Thu mẫu răng (2 chiếc răng). Làm sạch, khô mẫu, cho vào phong bì đựng mẫu (hoặc ống falcon/ lọ nhựa sạch). Ghi đầy đủ thông tin bên ngoài vật đựng mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, tên vụ việc liên quan đến tử thi được thu mẫu.

–    Đối với hài cốt:

• Mẫu răng: Lấy từ 03 chiếc răng trở lên (Yêu cầu: Răng chắc, còn chân răng), cho vào phong bì đựng mẫu (hoặc ống falcon/ lọ nhựa sạch). Ghi đầy đủ thông tin bên ngoài vật đựng mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, ghi tên vụ việc liên quan đến hài cốt được thu mẫu.
• Mẫu xương: Lấy đoạn ở giữa xương ống chân (tay) dài khoảng 5 cm, (Yêu cầu: Xương chắc), cho vào phong bì đựng mẫu (hoặc ống falcon/ lọ nhựa sạch). Ghi đầy đủ thông tin bên ngoài vật đựng mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, ghi tên vụ việc liên quan mẫu được thu.
• Lập Biên bản thu mẫu .

– Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định (Trường hợp thời gian chờ giám định: trên 1 tháng cần bảo lạnh ở 2-8^oC; trên 1 năm cần bảo ở nhiệt độ âm 20^oC).

1.7. Thu mẫu vật chứng

Bước 1. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị hộp giấy hoặc phong bì to đựng mẫu.

Bước 2: Chụp ảnh mẫu.

Bước 3: Làm khô mẫu (Nếu mẫu vật dạng vải, giấy, sợi…):

Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng (hoặc dùng máy sấy tóc sấy ở mức độ nhẹ nhất) đến khi mẫu khô hoàn toàn.

Bước 4. Gói mẫu bằng giấy sạch rồi cho vào hộp giấy đóng niêm phong. Bên ngoài hộp giấy ghi rõ đầy đủ thông tin về mẫu: Tên mẫu, vị trí thu mẫu, ngày thu mẫu, ghi tên vụ việc liên quan đến mẫu.

Bước 6. Lập Biên bản thu và niêm phong mẫu.

Bước 7. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định (Trong trường hợp mẫu chưa khô hoàn toàn cần bảo quản lạnh từ âm 20⁰C đến khi giám định).

1.8. Thu mẫu vết sinh học tại hiện trường

Bước 1: Ghi thông tin của mẫu bên ngoài phong bì đựng mẫu.

Bước 2. Chụp ảnh vị trí thu mẫu trước khi thu mẫu.

Bước 3. Đeo găng tay, khẩu trang, chuẩn bị dụng cụ thu mẫu …

Bước 4. Thu mẫu như sau:

Dùng tăm bông phết tại vết sinh học nghi ngờ (vết máu, tinh dịch, vv…) trong trường hợp mẫu vết rõ ràng trên bề mặt không thể đưa trực tiếp đến cơ quan giám định (trên mặt đất, cột nhà bằng sắt/thép …). Nếu mẫu vết đã khô, dùng tăm bông thấm 01 giọt nước cất đã khử trùng trước khi phết.

Bước 5. Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút, sau đó cho mẫu vào trong phong bì đựng mẫu.

Bước 6. Lập Biên bản thu mẫu.

Bước 7. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ phòng đến khi làm giám định.

Chú ý:

Tìm và thu vết sinh học phải được tiến hành kịp thời, thận trọng, tỉ mỉ với sự trợ giúp của các phương tiện kỹ thuật chuyên dụng. Có thể sử dụng các Kit thu mẫu chuyên dụng, tham khảo hướng dẫn của nhà sản xuất.

1.9. Nhận, bảo quản mẫu giám định

– Đeo găng tay, khẩu trang.

– Ghi nhận tình trạng bảo quản mẫu.

– Kiểm tra niêm phong.

– Chụp ảnh mẫu còn nguyên niêm phong.

– Mở niêm phong.

– Kiểm tra mẫu: loại mẫu, số lượng mẫu, tình trạng mẫu.

– Chụp ảnh mẫu.

– Lập biên bản:

+ Biên bản giao nhận mẫu theo qui định (Trường hợp mẫu do cơ quan trưng cầu, người yêu cầu mang đến).

+ Biên bản mở niêm phong mẫu theo qui định (Trường hợp mẫu do cơ quan trưng cầu, người yêu cầu gửi qua đường bưu điện).

– Tùy theo tình trạng mẫu chọn phương pháp bảo quản ở nhiệt độ phòng hay nhiệt độ lạnh.

2. Chuẩn bị mẫu

Tùy theo từng loại mẫu sử dụng các bước như sau:

2.1. Mẫu máu

Cắt khoảng 0,2- 0,5 cm² vết máu khô thành từng mảnh nhỏ cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

2.2. Mẫu chân lông/tóc

Cắt 1-2 chân lông/tóc cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

2.3. Mẫu tế bào niêm mạc miệng

Tách phần ngoài đầu tăm bông cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

2.4. Mẫu móng tay/móng chân

+ Dùng dao cạo sạch những chất bẩn trên móng tay/chân.

+ Dùng tăm bông thấm cồn lau sạch nhiều lần móng tay/chân, sau đó để khô tự nhiên.

+ Cắt nhỏ mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml sạch, sau đó rửa mẫu từ 2 – 3 lần bằng nước deion đã khử trùng.

2.5.  Mẫu mô

Cắt mẫu mô khoảng 0,05 mm² cho vào ống ly tâm 1,5 ml sạch, sau đó rửa mẫu từ 2 – 3 lần bằng nước deion đã khử trùng.

2.6. Mẫu xương/răng

* Làm sạch bằng cơ học

– Làm sạch bên ngoài mẫu xương/răng bằng cơ học.

– Đối với mẫu xương, cưa nhỏ thành các miếng khoảng 1 cm², mài sạch phần đã phân hủy bên ngoài và bên trong ống xương bằng máy mài.

* Làm sạch bằng hoá chất

– Rửa xương/răng bằng Natri hypoclorit 1% – 5%, trong 20 – 40 giây (tùy theo chất lượng mẫu).

– Rửa lại bằng nước khử ion vô trùng, không chứa ADN (lặp lại 3 lần).

– Ngâm mẫu xương/răng trong Ethanol 100% trong 10 phút.

– Để khô mẫu xương/răng ở nhiệt độ phòng, trong 3 – 5 giờ (hoặc cho đến khi mẫu khô hoàn toàn).

* Nghiền mẫu xương/răng

– Nghiền xương/răng bằng máy nghiền chuyên dụng sử dụng trong phòng thí nghiệm.

– Lấy ≤ 100 mg bột xương/răng đã nghiền vào ống ly tâm 15 ml.

2.7. Các mẫu vết sinh học khác

Sử dụng một trong các cách sau:

– Cắt trực tiếp vào vật mang vết mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

– Dùng tăm bông chuyên dụng phết vết mẫu, cắt phần bông cho vào ống ly tâm 1,5 ml.

– Dùng băng dính chuyên dụng (sản phẩm thương mại được thiết kế đặc biệt chuyên dùng cho thu mẫu vết phục vụ giám định ADN) thu mẫu vết, cho băng dính vào ống thu được cung cấp kèm theo băng dính.

(Chú ý: Có thể sử dụng các kit thu mẫu chuyên dụng khác).

3. 3. Tách chiết ADN

3.1. Tách chiết ADN từ mẫu máu, chân tóc, niêm mạc miệng

Bước 1: Bổ sung 1 ml đệm PBS vào ống ly tâm đã đựng mẫu, vortex 5 – 10 giây, ly tâm nhanh, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

Bước 2. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 3. Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn. (Lặp lại các bước 1, 2, 3 thêm 2 lần để làm sạch mẫu).

Bước 4. Bổ sung 150 – 200 µl dung dịch Chelex^®100 10%, 10 – 15 µl dung dịch proteinase K (10 mg/ml).

Bước 5: Ly tâm nhanh.

Bước 6. Ủ mẫu trong máy lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 56°C trong 30 – 60 phút.

Bước 7. Ủ mẫu trong máy lắc ổn nhiệt ở 100°C trong 5 phút.

Bước 8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, hút dịch nổi sang ống ly tâm 1,5 ml mới và bảo quản ở nhiệt độ -20°C nếu chưa sử dụng ngay.

Chú ý: Tách chiết ADN bằng các bộ hóa chất khác cần tham khảo thêm hướng dẫn của nhà sản xuất.

3.2. Tách chiết ADN từ mẫu móng tay/chân, mẫu mô, mẫu vết sinh học

Sử dụng QIAamp^® DNA Micro Kit (Qiagen – Đức).

Bước 1: Bổ sung 180 ml đệm ATL và 20 ml proteinase K (20mg/ml) vào ống ly tâm chứa mẫu, trộn đều bằng máy vortex 15 giây.

Bước 2: Cho ống ly tâm vào máy lắc ổn nhiệt ủ ở 56^oC, trong 2 – 4 giờ hoặc qua đêm.

Bước 3: Bổ sung 200 ml đệm AL, trộn đều bằng máy vortex 15 giây.

Bước 4: Bổ sung 200 ml Ethanol (96-100%), vortex kỹ khoảng 15 giây, để ở nhiệt độ phòng (15 – 25^o C) trong 5 phút.

Bước 5: Ly tâm nhanh.

Bước 6: Chuyển toàn bộ dung dịch ly giải sang cột QIAamp^® MinElute (trong ống 2 ml). Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Đặt cột sang ống 2 ml mới. Bỏ ống chứa dịch.

Bước 7: Bổ sung 500 ml đệm AW1. Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Đặt cột sang ống 2 ml mới. Bỏ ống chứa dịch.

Bước 8: Bổ sung 500 ml đệm AW2. Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Đặt cột sang ống 2 ml mới. Bỏ ống chứa dịch.

Bước 9: Ly tâm 14000 vòng/ phút trong 3 phút để màng khô hoàn toàn.

Bước 10:  Đặt cột vào ống ly tâm 1,5 ml. Bỏ ống chứa dịch. Cho thêm từ 20 -100 ml dung dịch AE vào giữa màng lọc.

Bước 11: Đậy nắp, để ở nhiệt độ phòng (15 – 25^oC) trong 1- 5 phút. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút.

Bước 12:. Thu dịch chứa ADN và bảo quản ở – 20^oC.

Chú ý: Tách chiết ADN với các bộ hóa chất khác cần tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất.

3.3. Tách chiết ADN từ mẫu xương/răng

Sử dụng QIAamp^® DNA Investigator kit (Qiagen – Đức).

Bước 1: Lấy ≤ 100 mg bột xương/răng đã nghiền vào ống ly tâm 15 ml. Bổ sung 360 µl ATL và thêm 20 µl proteinase K. Ủ qua đêm ở 56^oC.

Bước 2: Ly tâm nhanh.

Bước 3: Thêm 300 µl đệm AL, đóng nắp, trộn đều bằng máy vortex trong 10 giây.

Bước 4: Ủ 70^oC, lắc ở 900 vòng/phút trong 10 phút trong máy lắc ổn nhiệt.

Bước 5: Ly tâm tốc độ cao (20.000 x g hoặc 14.000 vòng/phút) trong 1 phút, và hút dịch nổi sang ống ly tâm 1,5 ml mới.

Bước 6: Thêm 150 ml Ethanol (96% – 100%). Đóng nắp lại, trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây.

Bước 7: Ly tâm nhanh.

Bước 8: Chuyển toàn bộ dịch ở phân giải sau bước 7 lên cột QIAamp^® MinElute (trong ống thu 2 ml) một cách cẩn thận, không làm dính ướt lên mép cột.

Bước 9: Đóng nắp, ly tâm 6000 x g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp MinElute sang ống thu 2 ml mới. Bỏ ống thu có chứa dịch qua cột.

Bước 10: Mở nắp cột QIAamp MinElute một cách cẩn thận, bổ sung 600 µl đệm AW1 mà không làm ướt mép cột, ly tâm 6000 x g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp MinElute sang ống thu mới. Bỏ ống thu có chứa dịch qua cột.

Bước 11: Mở nắp cột QIAamp MinElute một cách cẩn thận, bổ sung 700 µl đệm AW2 mà không làm ướt mép cột. Ly tâm 6000 x g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp Minelute sang ống thu mới. Bỏ ống thu có chứa dịch qua cột.

Bước 12: Mở nắp cột QIAamp MinElute một cách cẩn thận, bổ sung 700 µl Ethanol (96-100%) mà không làm ướt mép cột. Ly tâm 6000 x g (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Chuyển cột QIAamp Minelute sang ống thu 2 ml mới, bỏ ống thu có chứa dịch qua cột.

Bước 13: Ly tâm ở tốc độ cao (20.000 x g; 14.000 vòng/phút ) trong 3 phút để làm khô màng hoàn toàn.

Bước 14: Chuyển cột QIAamp Minelute sang ống ly tâm 1,5 ml và bỏ ống thu có chứa dịch qua cột. Mở nắp cột QIAamp Minelute, ủ nhiệt độ phòng (15 -25^oC) trong 10 phút hoặc ở 56^oC trong 3 phút.

Bước 15: Bổ sung 20 – 50 µl đệm AE hoặc nước cất (yêu cầu nước không chứa ADN) vào giữa màng.

Bước 16: Đậy nắp và để nhiệt độ phòng (15 -25^oC) trong 1 – 5 phút. Ly tâm ở tốc độ cao (20.000 x g; 14.000 vòng/phút) trong 1 phút.

Bước 17: Thu dịch chứa ADN và bảo quản ở nhiệt độ -20^oC.

Chú ý: Tách chiết ADN bằng các kit hóa chất khác cần tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất.

4. 4. Định lượng ADN

Sử dụng hóa chất Quantifiler^TM Trio DNA Quantification kit (ABI) trên máy Realtime PCR 7500.

 Xây dựng đường chuẩn

• Pha dãy chuẩn: Pha loãng mẫu chuẩn Quantifiler™ THP DNA Standard thành các nồng độ khác nhau theo hướng dẫn trong bảng dưới.

 

Tên mẫu chuẩn	Nồng độ (ng/µl)	Tỷ lệ pha
Std.1	50.000	10 µl [100 ng/µl stock] + 10 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer
Std.2	5.000	10 µl [Std.1] + 90 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer
Std.3	0.500	10 µl [Std. 2] + 90 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer
Std.4	0.050	10 µl [Std. 3] + 90 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer
Std.5	0.005	10 µl [Std. 4] + 90 µl Quantifiler™ THP DNA dilution buffer

 

Chuẩn bị phản ứng PCR

• Thành phần mỗi phản ứng gồm:

Quantifiler™ Trio Primer Mix: 8 µl

Quantifiler™ THP PCR Reaction Mix: 10 µl

ADN: 2 µl

• Chu trình nhiệt

Nhiệt độ	Thời gian	Chu kỳ
90oC	2 phút
95oC	9 giây	40 chu kỳ
60oC	30 giây

 

Chạy trên máy 7500 Real-Time PCR như hướng dẫn trong bộ kit của nhà sản xuất.

Phân tích dữ liệu

Dựa vào bảng số liệu để phân tích từng chỉ số và đưa ra nồng độ mẫu đầu vào thích hợp cho các phản ứng PCR tiếp theo.

Chú ý: Tùy thuộc vào điều kiện phòng thí nghiệm có thể sử dụng các phương pháp định lượng ADN tổng số bằng máy đo OD, điện di trên gel agarose hoặc một số phương pháp khác nhưng kết quả định lượng không cho độ chính xác cao như phương pháp Real time PCR.

5. Phản ứng khuếch đại ADN (PCR)

 Trình tự mồi tham khảo sử dụng trong phân tích ADN ty thể

 

Tên mồi	Trình tự mồi	Vùng khuếch đại
F15971	5’-TTA ACT CCA CCA TTA GCA CC-3’	HV1
R16391	5’- GAG GAT GGT GGT CAA GGG AC-3’
F15	5’- CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG-3’	HV2
R408	5’- ATT ATT TAT CGC ACC TAC GT-3’
F403	5’-TCT TTT GGC GGT ATG CAC TTT-3’	HV3
R635	5’-GAT GTG AGC CCG TCT AAA CA-3’

Thành phần phản ứng PCR

 

Thành phần	Thể tích
2x PCR Master mix	12,5 µl
Mồi 10 pmol/µl	1    µl
ADN (5 ng/µl)	1    µl
H2O	10,5 µl

 

Chu trình nhiệt PCR

– Vùng HV1 và HV2

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
950C	5 phút
940C	20 giây	35 chu kỳ
610C	30 giây
720C	30 giây
720C	10 phút
40C	Giữ nhiệt	∞

 

• Vùng HV3

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
950C	11 phút
940C	30 giây	35 chu kỳ
560C	30 giây
720C	60 giây
720C	7 phút
40C	Giữ nhiệt	∞

 

Chú ý: Có thể sử dụng các cặp mồi khác với chu trình PCR khác để phân tích ADN ty thể tùy theo từng phòng thí nghiệm.

6. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Điện di trên gel agarose 1 – 2%:

– Chuẩn bị pha gel agarose 1,8 % (100 ml Đệm TBE 1X + 1 g agarose).

– Ngâm agarose trong đệm TBE 1X trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

– Đun sôi hỗn hợp trong lò vi sóng cho đến khi gel hòa tan hoàn toàn.

– Lấy cốc gel agarose ra khỏi lò vi sóng, lắc kỹ. Để nguội còn 50 – 60^o C.

– Đổ agarose vào khuôn, tạo giếng bằng lược dày 4 mm, để gel đông lại trong khoảng 1,5 – 2 giờ.

– Tra hỗn hợp gồm 5 µl mẫu + 2 µl loading dye vào các giếng.

– Chạy điện di gel trong đệm TBE 1X trong 60 phút.

– Điện di sao cho ADN di động theo chiều từ cực âm đến cực dương (6 V/cm theo khoảng cách giữa hai điện cực).

– Nhuộm bản gel bằng Ethidium Bromide/Red-safe/Green safe (hoặc các chất nhuộm phù hợp khác).

– Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel.

– Đọc băng điện di:

Chú ý: Có thể kiểm tra sản phẩm PCR bằng các phương pháp khác tuỳ theo điều kiện phòng thí nghiệm.

7. Giải trình tự

7.1. Tinh sạch sản phẩm PCR

– Tinh sạch sản phẩm PCR bằng Wizard SV Gel and PCR Clean – Up System Kit (Promega – Mỹ).

Trước khi tinh sạch cần điện di trên gel agarose để thu được băng đặc hiệu, cắt băng và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

– Đo nồng độ sản phẩm PCR đã tinh sạch bằng máy Quantus™ Fluorometer (Promega – Mỹ).

Chú ý: Có thể sử dụng bộ hóa chất của hãng sản xuất khác, cần tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất.

7.2. Thực hiện PCR với BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

– Sử dụng bộ hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems – Mỹ)

– Thành phần PCR:

Thành phần	Thể tích
Ready Reaction Premix 2,5X	4 µl
BigDye Sequencing Buffer 5X	2 µl
Mồi	3.2 pmol
ADN khuôn	3 – 10 ng
H2O (lấy đủ phản ứng 20 µl)

 

– Chu trình nhiệt PCR:

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
960C	1 phút
960C	15 giây	25 chu kỳ
500C	5 giây
600C	4 phút
40C	Giữ nhiệt	∞

7.3. Tinh sạch sản phẩm PCR sau chạy PCR bigdye và giải trình tự

 Sử dụng BigDye^® X-Terminator^TM Purification Kit (Applied Biosystems – Mỹ)

Thành phần	Thể tích cho 1 mẫu
SAMTM solution	45 µl
XterminatorTM solution	10 µl
Sản phẩm PCR	10 µl

 

– Lắc trên máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 25 phút.

– Ly tâm nhanh, tra mẫu lên đĩa chạy mẫu.

– Đưa đĩa chạy mẫu vào máy 3500 Genetic Analyzer (Theomo Fisher scientific – Mỹ) chạy theo chương trình đã cài đặt trong máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chú ý: Có thể sử dụng các bộ hóa chất khác, máy giải trình tự khác cần tham khảo theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

8. Phân tích kết quả

Sau khi giải trình tự, sử dụng các phần mềm chuyên dụng như Sequencher^TM Version 5.0, Gene Codes Corporation Software, Sequecing Analysis 6… để phân tích trình tự ADN ty thể, đối chiếu với trình tự ADN tham khảo rCRS (Revised Cambridge Reference Sequence), so sánh các trình tự cần phân tích nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa những người có mẫu được phân tích.

Dữ liệu giải trình tự không nên sử dụng cho việc kết luận trong các trường hợp sau đây:

– Không đủ dữ liệu hoặc không thu thập được dữ liệu.

– Dữ liệu sau khi giải trình tự có các đỉnh quá thấp hoặc đường nền quá cao (dữ liệu không đáng tin cậy).

– Trình tự thu được không tương đồng với trình tự tham chiếu (Revised Cambridge Reference Sequence).

9.  Kết luận

Kết luận giám định căn cứ vào nội dung câu hỏi theo quyết định trưng cầu, yêu cầu giám định của cơ quan trưng cầu, người yêu cầu giám định và dựa trên kết quả phân tích.

– Phân tích và so sánh trình tự ADN ty thể của các mẫu.

– Tiêu chí đưa ra kết luận:

+ Không loại trừ có quan hệ huyết thống theo dòng mẹ: Khi trình tự nucleotide (trình tự ít nhất 300bp) của các mẫu hoàn toàn trùng khớp nhau.

+ Không đưa ra kết luận: Khi trình tự nucleotide giữa các mẫu sai khác nhau tại 1 vị trí nucleotide (có hoặc không có heteroplasmy).

+ Loại trừ: Khi trình tự nucleotide (trình tự ít nhất 250bp) của các mẫu có sự sai khác tại hai vị trí nucleotide trở lên (tại vị trí sai khác không có heteroplasmy).

1. HOÀN THÀNH, TRẢ KẾT QUẢ, LƯU TRỮ HỒ SƠ GIÁM ĐỊNH
2. Hoàn thành kết luận giám định

– Giám định viên hoàn thiện bản kết luận giám định trước khi trình lãnh đạo đơn vị duyệt. (Bản kết luận theo mẫu quy định)

– Giám định viên duyệt và ký bản chính thức kết luận giám định

– Lãnh đạo đơn vị ký bản kết luận giám định.

– Đóng dấu bản kết luận giám định.

2. Trả kết luận giám định

– Trả bản Kết luận giám định, kèm theo toàn bộ mẫu còn lại sau khi giám định (nếu có):

+ Trả trực tiếp cho cơ quan trưng cầu/người yêu cầu giám định: Có biên bản giao nhận kết quả giám định.

+ Trả theo đường bưu chính theo hình thức gửi đảm bảo và có ký giao, nhận giữa các bên.

3. Lưu hồ sơ giám định

– Toàn bộ hồ sơ giám định được thiết lập, lưu tại cơ quan giám định theo quy định chung và quy định của cơ quan giám định

4. Lưu mẫu sau giám định

– Các mẫu sau khi giám định được lưu giữ ở nhiệt 25⁰C, độ ẩm dưới 50% (đối với mẫu khô) hoặc âm 20⁰C (đối với mẫu chưa khô) trong thời gian chờ bàn giao lại cho cơ quan trưng cầu giám định.

– Các trường hợp thời gian lưu giữ mẫu trên 6 tháng, Cơ quan trưng cầu cần chi trả phí lưu giữ mẫu cho cơ quan giám định.

5. Lưu giữ mẫu ADN sau giám định

Lưu giữ mẫu ADN sau giám định ở nhiệt độ -20^oC/-40^oC/-80^oC.

Mẫu ADN được lưu giữ trong vòng 06 tháng sau khi ban hành kết luận giám định.